Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2019. Том 64. № 4. С. 18–24

DOI: 10.12737/article_5d11009f713799.54342353

А.А. Цишнатти^1,2, М.В. Пустовалова¹, А.К. Грехова¹, Ю.А. Бушманов¹, Т.А. Астрелина¹, И.В. Кобзева¹, В.А. Никитина¹, В.А. Брунчуков¹, Д.Ю. Усупжанова¹, И.М. Барабаш¹, Т.М. Блохина¹, Ю.А. Федотов¹, Н.Ю. Воробьева¹, А.С. Самойлов¹, А.Н. Осипов¹

Влияние облучения в сверхвысоких дозах на криоконсервированные мезенхимальные стволовые клетки: двунитевые разрывы ДНК и пролиферативная активность

1. Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва.
E-mail: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. ;
2. Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Москва

А.А. Цишнатти – техник;
М.В. Пустовалова – н.с.;
A.K. Грехова – м.н.с.;
Ю.А. Бушманов – зав. отделом;
Т.А. Астрелина – рук. центра биомедицинских технологий, д.м.н.;
И.В. Кобзева – зав. криобанка, к.м.н.;
В.А. Никитина – в.н.с., к.м.н.;
В.А. Брунчуков – м.н.с.;
Д.Ю. Усупжанова – м.н.с.;
И.М. Барабаш – зав. отделением;
Т.М. Блохина – н.с.;
Ю.А. Федотов – н.с.;
Н.Ю. Воробьева – зав. лаб., к.б.н.;
А.С. Самойлов – генеральный директор, д.м.н., проф. РАН;
А.Н. Осипов – зав. отделом, д.б.н., проф. РАН

Реферат

Цель: Провести сравнительную оценку влияния облучения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в сверхвысоких дозах при температуре жидкого азота (–196 °С) и комнатной температуре (22 °С) на выход остаточных двунитевых разрывов (ДР) ДНК и на пролиферативную активность размороженных МСК.

Материал и методы: Выделение и культивирование МСК проводили по стандартной методике. Для криоконсервации клеток использовали диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 10 %. Для облучения клеток тормозным фотонным излучением с номинальной энергией фотонов 5 МэВ использовали ускоритель УЭЛР-10-100-Т-100 (Россия). Клетки облучали в дозах 50 и 500 Гр при температуре +22 °С и –196 °С. Выход остаточных ДР ДНК оценивали с помощью иммуноцитохимического анализа фокусов белка-маркера ДР – γH2AX. Для оценки пролиферативной активности анализировали долю Ki67 (белок-маркер клеточной пролиферации) позитивных клеток.

Результаты: Результаты оценки фокусов γH2AX в МСК через 48 ч после облучения в дозе 50 Гр показали, что количество остаточных фокусов γH2AX в ядрах МСК, облученных при температуре +22 °С, примерно в 3,2 раза (р = 0,0002) выше, чем в ядрах МСК, облученных при температуре –196 °С. Анализ пролиферативной активности клеток с использованием молекулярного маркера клеточной пролиферации белка Ki67 показал, что клетки, облученные в дозе 50 Гр при температуре +22 °С, полностью теряют способность к пролиферации. Пролиферативная активность клеток, облученных в той же дозе, но при температуре –196 °С, существенно снижается, но часть клеток (3,5±1,1 %) все же сохраняет способность к пролиферации. После облучения дозе 500 Гр при –196 °С клетки полностью теряют способность к пролиферации, но частично сохраняют способность к адгезии. Интегральная флуоресценция конъюгированных с флурохромом антител к γH2AX ядер МСК, облученных в дозе 500 Гр при температуре –196 °С, в 1,8 раза ниже, чем у ядер, облученных при температуре +22 °С.

Заключение: Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что криоконсервированные МСК, облученные при температуре жидкого азота (–196 °С) в среде для консервации, содержащей 10 % ДМСО, могут переносить воздействие ИИ в больших дозах (до 50 Гр). Однако при этом наблюдается довольно высокий выход остаточных ДР ДНК и очень низкая пролиферативная активность, что делает их непригодными в клинической практике. Представляется перспективным использование количественного анализа фокусов γH2AX для оценки поврежденности генома и функционального состояния клеток, облученных при температуре жидкого азота.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, криоконсервация, двунитевые разрывы ДНК, клеточная пролиферация, тормозное излучение, сверхвысокие дозы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Pezeshk A. The effects of ionizing radiation on DNA: the role of thiols as radioprotectors. Life sciences. 2004 Mar 26;74(19):2423-9. PubMed PMID: 14998719.
2. Ashwood-Smith MJ, Friedmann GB. Lethal and chromosomal effects of freezing, thawing, storage time, and x-irradiation on mammalian cells preserved at –196 degrees in dimethyl sulfoxide. Cryobiology. 1979 Apr;16(2):132-40. PubMed PMID: 573193.
3. Pustovalova M, Astrelina T, Grekhova A, Vorobyeva N, Tsvetkova A, Blokhina T, et al. Residual gammaH2AX foci induced by low dose x-ray radiation in bone marrow mesenchymal stem cells do not cause accelerated senescence in the progeny of irradiated cells. Aging. 2017 Nov 21;9(11):2397-410. PubMed PMID: 29165316. Pubmed Central PMCID: 5723693.
4. Pustovalova M, Grekhova A, Astrelina T, Nikitina V, Dobrovolskaya E, Suchkova Y, et al. Accumulation of spontaneous gammaH2AX foci in long-term cultured mesenchymal stromal cells. Aging. 2016 Dec 11; 8(12):3498-506. PubMed PMID: 27959319. Pubmed Central PMCID: 5270682.
5. Wang F, Yu M, Yan X, Wen Y, Zeng Q, Yue W, et al. Gingiva-derived mesenchymal stem cell-mediated therapeutic approach for bone tissue regeneration. Stem Cells and Development. 2011 Dec; 20(12):2093-102. PubMed PMID: 21361847.
6. Haack-Sorensen M, Kastrup J. Cryopreservation and revival of mesenchymal stromal cells. Meth. Mol. Biol. 2011;698:161-74. PubMed PMID: 21431518.
7. Ozerov IV. Mathematical modeling of the double-strand DNA breaks induction and repair processes in mammalian cells under the rarely ionizing radiation action with different dose rates: PhD thesis of physics. Moscow. SRC – FMBC. 2015. (Russian).
8. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-7. PubMed PMID: 16923606.
9. Kotenko KV, Bushmanov AY, Ozerov IV, Guryev DV, Anchishkina NA, Smetanina NM, et al. Changes in the number of double-strand DNA breaks in Chinese hamster V79 cells exposed to gamma-radiation with different dose rates. Int J Mol Sci. 2013. Jul 01; 14 (7):13719-26. PubMed PMID: 23880845. Pubmed Central PMCID: 3742213.
10. Harper JW, Elledge SJ. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 2007. Dec 14; 28 (5):739-45. PubMed PMID: 18082599. Epub 2007/12/18. eng.
11. Osipov AN, Lizunova EY, Gur’ev DV, Vorob’eva NY. Genome damage and reactive oxygen species production in the progenies of irradiated CHO-K1 cells. Biophysics. 2011; 56 (5):931-5.
12. Wang W, Li C, Qiu R, Chen Y, Wu Z, Zhang H, et al. Modelling of Cellular Survival Following Radiation-Induced DNA Double-Strand Breaks. Sci Rep. 2018 Nov 1;8(1):16202. PubMed PMID: 30385845. Pubmed Central PMCID: 6212584.
13. Ceccaldi R, Rondinelli B, D’Andrea AD. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 2016 Jan; 26(1):52-64. PubMed PMID: 26437586. Pubmed Central PMCID: 4862604.
14. Mladenov E, Magin S, Soni A, Iliakis G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Semin Cancer Biol. 2016 Jun; 37-38:51-64. PubMed PMID: 27016036.
15. Shibata A. Regulation of repair pathway choice at two-ended DNA double-strand breaks. Mutation Res. 2017 Oct; 803-805:51-5. PubMed PMID: 28781144.
16. Shibata A, Jeggo PA. DNA double-strand break repair in a cellular context. Clin Oncol. 2014 May; 26(5):243-9. PubMed PMID: 24630811.
17. Banath JP, Klokov D, MacPhail SH, Banuelos CA, Olive PL. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 2010 Jan 5; 10: 4. PubMed PMID: 20051134. Pubmed Central PMCID: 2819996.
18. Osipov AN, Grekhova A, Pustovalova M, Ozerov IV, Eremin P, Vorobyeva N, et al. Activation of homologous recombination DNA repair in human skin fibroblasts continuously exposed to X-ray radiation. Oncotarget. 2015 Sep 29; 6 (29):26876-85. PubMed PMID: 26337087. Pubmed Central PMCID: 4694959.
19. Lucas CC, Melo LR, de Sousa M, de Morais GB, Martins MF, Xavier FAF, et al. Cryoprotectant agents and cooling effect on embryos of Macrobrachium amazonicum. Zygote. 2018 Apr; 26(2):111-8. PubMed PMID: 29655380.
20. Smetanina NM, Pustovalova MV, Osipov AN. Effect of dimethyl sulfoxide on the extent of DNA single-strand breaks and alkali-labile sites induced by 365 nm UV-radiation in human blood lymphocyte nucleoids. Radiation Biology. Radioecology. 2014 Mar-Apr; 54(2):169-73. PubMed PMID: 25764818. (Russian).
21. Osipov AN, Smetanina NM, Pustovalova MV, Arkhangelskaya E, Klokov D. The formation of DNA single-strand breaks and alkali-labile sites in human blood lymphocytes exposed to 365-nm UVA radiation. Free Radical Biology & Medicine. 2014 Aug; 73:34-40. PubMed PMID: 24816295.

Для цитирования: Цишнатти А.А., Пустовалова М.В., Грехова А.К., Бушманов Ю.А., Астрелина Т.А., Кобзева И.В., Никитина В.А., Брунчуков В.А., Усупжанова Д.Ю., И.М. Барабаш, Блохина Т.М., Федотов Ю.А., Воробьева Н.Ю., Самойлов А.С., Осипов А.Н. Влияние облучения в сверхвысоких дозах на криоконсервированные мезенхимальные стволовые клетки: двунитевые разрывы ДНК и пролиферативная активность // Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2019. Т. 64. № 4. С. 18–24.

DOI: 10.12737/article_5d11009f713799.54342353

PDF (RUS) Полная версия статьи