Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2020. Том 65. № 1. С. 37–41

О.Д. Брагина¹, А.Г. Воробьева⁵, В.М. Толмачев⁵, А.М. Орлова⁵, В.И. Чернов^1,2, С.М. Деев^2,4, Г.Н. Прошкина⁴, А.А. Шульга⁴, М.С. Ларькина³, А.А. Медведева¹, Р.В. Зельчан¹

In vitro и in vivo оценка радиохимического соединения на основе меченного ^99mTс каркасного белка DARPin9_29 для молекулярной визуализации злокачественных образований с гиперэкспрессией Her2/neu

1. Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр, Томск
2. Национальный исследовательский Томский политехнический университет, Томск
3. Сибирский государственный медицинский университет, Томск
4. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва
5. Уппсальский университет, Уппсала, Швеция
Контактное лицо: Брагина Ольга Дмитриевна Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Реферат

Введение: Для обеспечения направленной доставки радионуклидов при диагностике злокачественных новообразований активно используют молекулы, связывающиеся со специфическим «таргетным» антигеном. В последние годы исследуется возможность применения для этих целей адресных молекулярных структур DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein). Одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, гиперэкспрессия которого определяется на поверхности опухолевых клеток.

Цель: Изучение эффективности радиохимического соединения на основе меченных ^99mTc адресных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu.

Материал и методы: Последовательность DARPin9_29 была амплифицирована с плазмиды pET-DARP-6HIS для экспрессии гена DARPin9_29-His6 в клетках E. coli. Элюат ^99mTcO₄- (400–500 мкл, 4 ГБк) был добавлен в набор для приготовления трикарбонила технеция [^99mTc(H₂O)₃(CO)₃]+ (CRS Kit, Швейцария) с последующей инкубацией при температуре 100 °С в течение 20 мин. После инкубации 40 мкл [^99mTc(H₂O)₃(CO)₃]+ было добавлено к 168 мкг DARPin9_29 в 100 мкл PBS (натрий-фосфатный буфер) с последующей инкубацией при температуре 40 °С в течение 60 мин. Радиохимические выход и чистота определялись с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), очищение проводилось с использованием очищающих колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Для изучения специфичности исследуемого радиофармацевтического соединения использовались клеточные линии с различным уровнем экспрессии Her2/neu: SKOV-3 > BT474 >> DU-145. Для проведения in vitro исследования использовалась экспрессирующая Her2/neu клеточная линия SKOV-3. Исследование проводилось через 6 ч после введения препарата.

Результаты: Радиохимический выход составил 72 ± 8 %, радиохимическая чистота после очищения – 98,7 ± 1,0 %. Показатели стабильности в растворе PBS через 1 ч составили 99,8 ± 0,2; через 3 ч – 98,2 ± 0,1. Данные in vitro исследований продемонстрировали, что накопление изучаемого соединения прямо пропорционально уровню экспрессии Her2/neu клеток, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого протеина отмечается значительное снижение связывания в группе клеток. Данные по биораспределению и ОФЭКТ/КТ в организме животного BALB/c nu/nu через 6 ч после введения радиофармпрепарата продемонстрировали быстрое выведение соединения из кровотока и высокую аккумуляцию в опухоли, печени, почках и мочевом пузыре.

Заключение: Проведенные исследования продемонстрировали высокие показатели радиохимического выхода и чистоты, а также стабильность изучаемого соединения. Результаты in vitro и in vivo анализа показали специфичность и аффинность радиофармпрепарата к рецептору Her2/neu на поверхности опухолевых клеток. Выявленная при in vivo исследованиях высокая аккумуляция препарата в печени и почках, вероятно, обусловлена липофильностью ^99mTc(CO)₃-, связанной с гексагистидиновым концом, и свидетельствует об ограничении его дальнейшего клинического использования в оценке состояния указанных выше органов, что потребует дополнительных методов диагностики, а также возможной модификации химической структуры.

Ключевые слова: злокачественные опухоли, Her2/neu, радионуклидная диагностика, DARPin9_29

Для цитирования: Брагина О.Д., Воробьева А.Г., Толмачев В.М., Орлова А.М., Чернов В.И., Деев С.М., Прошкина Г.Н., Шульга А.А., Ларькина М.С., Медведева А.А., Зельчан Р.В. In vitro и in vivo оценка радиохимического соединения на основе меченного ^99mTс каркасного белка DARPin9_29 для молекулярной визуализации злокачественных образований с гиперэкспрессией Her2/neu. Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2020;65(1):37-41.

DOI: 10.12737/1024-6177-2020-65-1-37-41

Список литературы / References

1. Чернов ВИ, Медведева АА, Синилкин ИГ, и др. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований. Бюллетень сибирской медицины. 2018;17(1):220-31. [Chernov VI, Medvedeva AA, Sinilkin IG, Zelchan RV, Bragina OD, Choynzonov EL. Nuclear medicine as a tool for diagnosis and targeted cancer therapy. Bulletin of Siberian Medicine. 2018;17(1):220-31. (In Russ.)].
2. Чернов ВИ, Брагина ОД, Синилкин ИГ, и др. Радиоиммунотерапия: современное состояние проблемы. Вопросы онкологии. 2016;62(1):24-30. [Chernov VI, Bragina OD, Sinilkin IG, Medvedeva AA, Zel’chan RV Radioimmunotherapy: current state of the problem. Oncology issues. 2016;62(1):24-30. (In Russ.)].
3. Брагина ОД, Чернов ВИ, Зельчан РВ, и др. Альтернативные каркасные белки в радионуклидной диагностике злокачественных заболеваний. Бюллетень сибирской медицины. 2019;3(18):125-133. [Bragina OD, Chernov VI, Zelchan RV, Sinilkin IG, Medvedeva AA, Larkina MS. Alternative scaffolds in radionuclide diagnosis of malignancies. Bulletin of Siberian Medicine. 2019;18(3):125-133. (In Russ.)].
4. Чернов ВИ, Брагина ОД, Синилкин ИГ, и др. Радиоиммунотерапия в лечении злокачественных образований. Сибирский онкологический журнал. 2016;15(2):101-6. [Chernov VI, Bragina OD, Sinilkin IG, Medvedeva AA, Zel’chan RV Radioimmunotherapy in the treatment of malignancies. Siberian journal of oncology. 2016;15(2):101-6. (In Russ.)].
5. Tamaskovic R, Simon M, Stefan N, Schwill M, Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy. Methods Enzymol. 2012; 503: 101–34.
6. Boersma YL, Pluckthun A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. Curr. Opin. Biotechnol. 2011; 22:849-57.
7. Брагина ОД, Ларькина МС, Стасюк ЕС, и др. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченных ^99mТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/ neu. Бюллетень сибирской медицины. 2017;16(3):25-33. [Bragina OD, Larkina MS, Stasyuk ES, Chernov VI, Yusubov MS, Skuridin VS et.al. Development of highly specific radiochemical compounds based on 99mTc-labeled recombinant molecules for targeted imaging of cells overexpressing Her-2/ neu. Bulletin of Siberian Medicine. 2017;16(3):25-33. (In Russ.)].
8. Vorobyeva A, Bragina O, Altai M, Mitran B, Orlova A, Shulga A et al. Comparative Evaluation of Radioiodine and Technetium-Labeled DARPin9_29 for Radionuclide Molecular Imaging of HER2 Expression in Malignant Tumors. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018; 2018: 6930425.
9. Goldstein R, Sosabowski J, Livanos M, Leyton J, Vigor K, Bhavsar G et al. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2015;42(2):288-301.
10. Lindbo S, Garousi J, Mitran B, Altai M, Buijs J, Orlova A et al. Radionuclide Tumor Targeting Using ADAPT Scaffold Proteins: Aspects of Label Positioning and Residualizing Properties of the Label. J Nucl Med. 2018;59(1):93-9.
11. Plückthun A Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55:489-511.
12. Garousi J, Honarvar H, Andersson KG, Mitran B, Orlova A, Buijs J et al. Comparative Evaluation of Affibody Molecules for Radionuclide Imaging of in vivo Expression of Carbonic Anhydrase IX. Mol Pharm. 2016 Nov 7;13(11):3676-87.
13. Nicholes N, Date A, Beaujean P, Hauk P, Kanwar M, Ostermeier M. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins. Protein Engineering, Design and Selection. 2016; 29:77-85.
14. Kramer L, Renko M, Završnik J, Turk D, Seeger MA, Vasiljeva O et al. Non-invasive in vivo imaging of tumour- associated cathepsin B by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8:2806-21.
15. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235:177–82.
16. Zavyalova M, Vtorushin S, Krakhmal N, Savelieva O, Tashireva L, Kaigorodova E et al. Clinicopathological features of nonspecific invasive breast cancer according to its molecular subtypes. Experimental Oncology. 2016;38(2):122-27.
17. Vorobyeva A, Garousi J, Tolmachev V, Schulga A, Konovalova E, Deyev SM et al. Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of ^99mTc-labeled DARPinG3. Scientific Reports. 2019; 9 (1): 9405.
18. Чернов ВИ, Брагина ОД, Синилкин ИГ и др. Радионуклидная тераностика злокачественных образова- ний. Вестник рентгенологии и радиологии. 2016;97(5):306-13. [Chernov VI, Bragina OD, Sinilkin IG, Medvedeva AA, Zel’chan RV Radionuclide teranostic of malignancies. Journal of Radiology and Nuclear Medicine. 2016;97(5):306-13. (In Russ.)].

PDF (RUS) Полная версия статьи

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполняется в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по теме «Доклинические исследования радиофармацевтического препарата на основе меченных 99mTc рекомбинантных адресных молекул для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией Her-2/neu».

Участие авторов. Cтатья подготовлена с равным участием авторов.

Поступила: 28.05.2018. Принята к публикации: 11.12.2019.